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中药研究中在线二维液相色谱的应用

时间:2017-03-30 来源:色谱 作者:高雯,宋慧鹏,杨华,李 本文字数:8630字
  摘要

        中药化学成分是中药药效的物质基础,但往往一味中药就囊括了从极性到非极性、从小分子到大分子的多种化合物,其组成极为复杂。因此,对中药化学成分进行全面、快速地表征一直是中药分析研究的热点与难点,也是研究和阐明中药药效物质基础的先决条件。在现代中药研究中,色谱技术尤其是液相色谱(LC)作为最常用的分离、分析手段扮演着不可替代的角色。多维液相色谱的建立和运用也为中药物质基础表征和活性成分筛选提供了新技术。本文对在线二维(2D)液相色谱技术在中药研究中的应用进行了综述,以期为中药现代化研究提供新的思路。
  
  1二维液相色谱的发展及类型
  
  近20年,色谱柱的固定相类型、填料粒径和高压系统的发展大大提高了色谱分析的速度,色谱的分离模式也逐渐由一维模式向多维模式发展[1].根据多维色谱联用的总峰容量约等于各维峰容量的乘积这一理论[2],将两种以上不同分离机理的色谱柱串联使用,可显着提高分析的分辨率和峰容量,适于中药复杂成分的分析和表征[3].
  
  最初建立的二维液相色谱为离线(off-line)模式,即将第一维(1D)色谱洗脱的馏分收集、浓缩后,再进行第二维(2D)色谱分析[4].这种方法的两个色谱柱往往不直接关联,不受流动相兼容问题的影响,因而可以采用不同分离机理的两种色谱进行分析,且仪器装置比较简单[5].然而离线模式在收集-浓缩-再分析的过程中样品易损失、重现性差,且耗时、耗力[6],因此从离线模式发展为在线(on-line)模式是当今二维液相色谱的发展趋势。在线二维模式是通过阀或相应部件将两根色谱柱相连,1D色谱洗脱的馏分自动进入2D液相色谱[7].在线模式可分为中心切割二维液相色谱(heart-cutting LC-LC)和全二维液相色谱(comprehensive LC×LC)两种。
  
  1.1中心切割二维液相色谱
  
  Heart-cutting LC-LC模式是指混合物经第一维色谱分离后,目标物的一个或几个组分通过在线切换依次转入第二维色谱,从而进一步分离分析。通常目标组分会按照出峰时间整个切入第二维,因此需要在第一维色谱后连接检测器进行监测。两维色谱之间常以六通阀进行连接,若第一维和第二维需采用不同的流动相,还会再增加一个定量环(loop环)或富集柱进行目标组分的收集或富集,其典型装置示意图见图1.六通阀首先在A位置,样品在第一维色谱柱上进行分析;当目标组分出峰并在loop环中完成收集后,六通阀切换到B位置,目标组分进入第二维色谱进行分离;此时第一维色谱可根据下一个目标组分的出峰时间继续分析或停止等待。该模式中第一维色谱和第二维色谱不(不必须)同时进行工作,完成一次分析所需时间为第一维色谱分析时间与第二维色谱分析时间之和,但与off-line模式相比,提高了自动化程度。在线模式方法的建立及条件优化主要考虑第一维色谱的切出/第二维色谱的切入时间,以及一维色谱馏分的体积对二维色谱峰展宽的影响。为使第一维切出的组分获得更好的分离,第二维通常选用更长的色谱柱及更多变的分析梯度。
  
  1.2全二维液相色谱
  
  全二维液相色谱模式是样品经第一维色谱分离后所有组分均通过阀切换转入第二维色谱进行分析的在线二维液相色谱模式。根据Schoenmakers等[8]提出的定义,全二维色谱需包含以下3个特征:(1)样品中所有成分的分离分析均经过两种模式;(2)所有样品成分均以同等比例经过两维分离柱后进入检测器;(3)样品中任意两个化合物在第一维色谱柱中的分离顺序和分离度会传递至第二维色谱柱。在所建立的全二维液相色谱系统中,第二维可采用两根平行的色谱柱进行交替分析[9],或通过在第一维色谱和第二维色谱间连接的两个loop环交替收集后,再分别进入第二维色谱。目前以loop环模式最为常用,通过二位八通阀、二位十通阀或双二位四通阀实现在线切换(见图2)。在进行分析时,切换阀首先在A位置,第一维色谱柱的洗脱液进入loop环1,收集相应时间后,切换阀转换到B位置,此时loop环1收集的组分进入第二维色谱柱进行分析,第一维色谱柱的洗脱液进入loop环2进行收集;相应时间后,切换阀切回到A位置,进行下一轮的收集和分析;如此往复进行,直至第一维色谱的洗脱液全部进入第二维色谱完成分析。二位八通阀和二位十通阀是全二维液相色谱较常用的切换阀,二位八通阀的连接流路比较简单,但其中一个loop环的收集和洗脱会出现不同方向的情况(见图2a);二位十通阀可以保证两个loop环收集和洗脱均同方向,但收集和洗脱的流路长短不一致(见图2b)。上述两种模式均因流路不对称对全二维液相色谱方法的建立和优化有较高要求。近期发展的双二位四通阀设计则可以实现流路的完全对称(见图2c),进一步简化了全二维液相色谱方法的建立和运用。
  
  全二维液相色谱的自动化程度更高,色谱峰数据也不再是典型的保留时间-响应高度的二维图,而是通过数据处理重新拟合生成的三维等高线图,即第一维色谱流出液到第二维色谱的切换不依赖于第一维色谱的出峰情况,而是将等时间的馏分交替切入第二维色谱中,因此全二维液相色谱的发展和建立依赖于仪器控制和数据处理软件的构建[10].此外,第二维色谱需交替分析第一维色谱洗脱的馏分,其分析一次的时间等于loop环收集一次样品的时间,分析次数等于两个loop环收集样品的总次数,因此整个全二维液相色谱一次分析的时长取决于第一维色谱的分析时间。在方法建立和条件优化时,需着重考虑第一维色谱流速和阀切换时间与loop环收集体积的匹配;loop环收集体积对第二维色谱峰展宽的影响;第二维色谱峰的分析效率;第一维和第二维色谱间流动相的兼容性。
  
  在色谱柱选择方面,全二维液相色谱的第一维通常采用微径色谱柱(micro-bore column)以低流速(μL/ min)进行洗脱,以减小loop环的收集体积,避免第二维色谱的色谱峰展宽;早期的第二维色谱常采用柱体积较大的色谱柱以降低高流速引起的高背压,且采用等度洗脱以减少色谱平衡时间。随着高压/超高压液相色谱的出现和发展,目前第二维色谱多采用超高压色谱柱以大流速快速完成分析。
  
  2二维液相色谱在中药分析中的应用
  
  2.1中药物质基础表征
  
  全二维液相色谱自1978年由Erni等[11]建立以来,在多肽等混合物样品分析中得到了广泛应用。邹汉法研究员课题组首先于2004年将构建的全二维液相色谱系统用于中药川芎的多成分分析[12].第一维采用氰基 (CN)柱 (200 mm × 2. 0 mm,5μm),以甲醇-水系统为流动相,在0. 04 mL / min的流速下梯度洗脱215 min,loop环的体积为200μL,收集5 min;第二维采用ODS柱(200 mm×2. 0mm,5 μm),以乙腈-0. 1%(v / v)乙酸水系统为流动相,在0. 7 mL/ min的流速下等度洗脱,完成一次分析需5 min,共分析43次,分析过程中随着第一维色谱柱洗脱梯度的变化改变第二维色谱的起始梯度,但在一次分析中仍保持等度洗脱。该反相×反相(RP×RP)的全二维色谱系统可较好地兼顾中药化学成分中大极性和小极性的化合物。应用该方法并结合质谱检测器,从川芎提取物中检测到了52种化合物。该课题组根据范氏方程进一步优化了第一维CN柱的流速(0. 13 mL/ min),并将第二维色谱柱更换为更耐压的ODS整体柱,以3. 0 mL/ min的流速洗脱,完成一次分析需1. 5 min,提高了色谱的分辨率,并通过改进色谱峰处理软件算法来区分相对丰度较低的峰,使改进的全二维LC×LC法的峰容量提高到2 440 peak/ 130 min,并从川芎的提取物中检测到120种化合物[13].在此基础上,邹汉法研究员课题组先后建立了脂质体柱-ODS柱系统用于银杏提取物、龙胆泻肝汤等中药成分的分析[14,15],为全二维液相色谱用于中药复杂成分的分析奠定了基础。
  
  本文对近10年报道的用于中药分析的全二维液相色谱法进行了总结(见表1)。可以看出,随着色谱柱填料类型的多样化、商品化,以及高压/超高压液相色谱系统的出现和数据处理软件的完善和普及,建立的全二维液相色谱方法更加简便,且应用范围更广。例如银杏叶提取物中的黄酮类成分较多,且几乎都是以山柰酚、槲皮素和异鼠李素作为苷原的结构类似物,采用一维色谱分析较困难,而采用二维色谱分析时,从银杏叶提取物中检测出了61种黄酮类化合物,其中25种化合物具有较好的活性[26],与一维色谱方法相比,分析能力大大提高。值得注意的是,由于流动相兼容性和大多数天然产物分离机制的限制,用于中药多成分分析的全二维液相色谱多为RP×RP模式。Tian等[19]和Wei等[20]构建了用于中药分析的正相×反相(NP×RP)全二维液相色谱模式,虽然通过控制流动相温度或改进接口可以克服流动相兼容问题,但在分析过程中,第一维色谱需暂停分析,等第二维分析结束后再继续进行,即第一维和第二维之间难以实现快速切换,分析时间较长。
  
高雯,宋慧鹏,杨华,李萍. 在线二维液相色谱技术在中药研究中的应用进展[J]. 色谱,2017,01:121-128.
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