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石蜡和冰冻切片检测牛蛙肝糖原的染色效果比较

时间:2015-01-17 来源:未知 作者:学术堂 本文字数:2685字
论文摘要

  肝糖原是人和动物体内的贮备多糖,有“动物淀粉”之称,肝糖原在酶促作用下合成和分解以维持血糖浓度稳定。检测肝糖原含量变化在医学病理学上可用于糖原累积病﹑糖尿病和某些肿瘤的诊断[1],在养殖生产实践中可用于了解动物的营养状况以指导合理饲喂。高碘酸希夫氏 (periodic acid-Schiff′s,PAS)染色法是检测糖原的经典组织化学方法,该法先用高碘酸将糖类相邻两个碳上的羟基氧化成醛基,再用Schiff's试剂(无色品红)和醛基反应产生红色或紫红色物质,红色的深浅反映组织细胞中糖原的含量。目前对肝糖原PAS染色过程中样品固定、染色试剂的配制与储存、染色时间等方面研究报道较多[2-4],切片方法均为石蜡切片,冰冻切片制作过程时间短、效率高,但尚未见有关用冰冻切片检测肝糖原的研究报道。

  牛蛙属经济养殖型蛙类,具有重要的生态价值和经济价值,也是重要的科研和教学用实验动物。

  本试验分别制作了牛蛙肝组织石蜡和冰冻切片,采用PAS染色法检测肝糖原,通过光密度分析测定糖原含量,比较了两种切片的染色效果,供相关教学与科研技术人员参考。

  材料和方法

  1.材料

  成体牛蛙3只,重250-300g,购自芜湖市黄山菜市场,穿刺脊髓处死,迅速解剖,取出肝脏,用吸水纸轻轻拭干,勿用水或生理盐水清洗。

  2.实验方法

  2.1石蜡切片

  将肝脏切成约1cm×1cm×0.5cm的小块,用Carnoy固定液于低温4℃固定约4h,分别用95%乙醇和无水乙醇脱水2h、二甲苯透明、浸蜡、包埋,常规切片厚5μm,水中展片。

  2.2冰冻切片

  将肝脏切成约0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块,放在组织支撑器上,滴加冷冻包埋剂后放入冰冻切片机中低温固化后切片,切片厚5μm。

  2.3PAS染色

  对照组取石蜡切片常规脱蜡至50%乙醇后稍水洗,与冰冻切片同时滴加唾液淀粉酶溶液于37℃温箱中消化处理30min,消化过程中实验组石蜡切片脱蜡至50%乙醇后稍水洗,将实验组、对照组的石蜡、冰冻切片入0.5%高碘酸氧化7min,流水冲洗5min再用蒸馏水浸洗两次;冰箱取出无色品红待至室温后避光染色15-20min;用0.5%的偏重亚硫酸钠漂洗两次,每次约1min,流水冲洗5min,蒸馏水洗 后Harris苏 木 精 染 色2 min;自 来 水 洗,0.1%的盐酸乙醇分化1 min,水洗充分后温水返蓝,流水冲洗,42℃温箱烘干24h,中性树胶封固。

  2.4光密度测定与数据统计分析

  在Olympus BX61型显微镜下观察拍照,采用Image-Pro Plus图像分析软件对染色阳性部位进行光密度分析,测出切片中PAS阳性部位的累积光密度(integrated optical density,IOD)和面积,算出平均光密度(mean optical density,MOD)。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行差异显着性比较,P<0.05为差异显着。

  结果

  PAS染色后糖原颗粒呈红色或紫红色,石蜡切片染色后肝脏组织结构较为清晰,但肝细胞内有较多空泡,糖原流失较多,且偏向了细胞的一侧(图1),冰冻切片肝细胞形态保持完好,糖原颗粒明显比石蜡切片中大,且糖原保持较好的原位状态(图2)。

  光密度分析显示冰冻切片糖原含量显着高于石蜡切片(P<0.05)(表1),与冰冻切片相比,石蜡切片中糖原流失了28%左右。

论文摘要

论文摘要

 

  讨论

  1.取材与固定

  制作石蜡切片时,不同的固定方法对肝糖原的显示影响较大,采用Carnoy固定液固定可较好地保存糖 原,此 外,低 温4℃下 固 定 也 可 防 止 糖 原 丢失[2];冰冻切片无需对材料进行固定处理,直接取材冷冻包埋后切片即可。

  2.切片与展片

  王珏等认为肝脏的石蜡切片厚度一般在3μm为宜,组织太厚或太薄均不利于观察[3]。制作3μm冰冻切片材料极易破碎,本实验冰冻切片厚度为5μm,染色后效果亦较为理想。有报道认为在70%酒精中展片可防止糖原流失染色效果较好,我们在实验中发现在70%酒精中和清水中展片染色效果无明显差异,可能是由于材料经石蜡包埋,短时间水中展片不会导致糖原的流失。

  3.试剂配制

  实验采用无色品红染色,本试剂因配制需活性炭吸附过滤,配制耗时较长,可适量多配制一些后在4℃冰箱避光保存。另外,本实验在配制无色品红时发现若未经活性炭吸附时溶液已基本无色,则该试剂与经活性炭吸附后的试剂染色效果相同。有研究认为,对于失效无色品红溶液,在约每100ml试剂中加入0.5g偏重亚硫酸钠,可恢复其染色能力[4],其他试剂均可现配现用。

  4.对照实验

  可用0.1%淀粉酶与37℃保温箱中反应1h左右,本实验发现将唾液稀释6-9倍于双层纱布过滤两次后在37℃保温箱中反应30min左右,效果亦较为理想。不过,反应时间应把握较为准确,时间太短糖原未分解彻底,时间太长又易致其它组织结构分解,且染色冲洗时易掉片。实验组两种切片经高碘酸氧化后均不易掉片,但对照组由于经过酶消化易掉片,冲洗时应小心,对照组染色后PAS阴性,证明实验组PAS阳性物质为糖原。

  5.染色结果

  石蜡切片染色后肝脏组织结构虽然较为清晰,但肝细胞内有较多空泡,可能是由于制片脱水过程中糖原溶解流失形成的。糖原偏向了细胞的一侧,有报道认为这是由于固定剂把细胞内的糖原推向固定剂对组织浸透的方向而造成[2];冰冻切片为切片后直接染色,因此可很好地保留糖原及其在细胞中的位置。

  总之,石蜡和冰冻两种切片方式均可用于糖原染色,由于糖原易溶于水,两种切片材料未经高碘酸氧化前均不宜与水接触,但制作石蜡切片时脱水脱蜡过程中不可避免要与水接触,必然会造成不同程度的糖原流失,而冰冻切片可直接切片染色,无需与水接触,不会造成糖原流失;石蜡切片制作实验环节较多,耗时较长,通常要48-72h,而冰冻切片制作实验环节较少、耗时短,只需5-6h。但冰冻切片需要冰冻切片机,价格较昂贵,没有石蜡切片机那么普及。本研究结果显示,在条件许可的情况下,临床病理诊断和生产实践中检测糖原含量变化时,应选用制作方便、耗时短且糖原不易流失的冰冻切片。

  参考文献

  [1]付银锋.PAS染色方法及应用.河南科技大学学报(医学版),2008,26(2):100-101

  [2]尹洪萍,袁红.不同固定方法对肝糖原显示的影响.杭州师范学院学报(自然科学版),2005,4(6):479-480

  [3]王珏,王莉,张健.不同组织中PAS染色的特点.郧阳医学院学报,2009,(5):505

  [4]方庆全,叶美华,黄红浪.提高病理高碘酸雪夫氏法染色效果的体会.临床和实验医学杂志,2009,8(12):125-126

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