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探讨Smad7对ActA/Smads通路的调控机制

时间:2014-07-11 来源:未知 作者:学术堂 本文字数:4525字
论文摘要

  激活素A(ActivinA,Act A)是转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族成员之一,其作为ActA/Smads信号通路的第一信使,通过触发下游细胞内Smads级联反应,完成具有一定生物学功能的信号转导过程。前期研究发现ActA/Smads通路具有抗缺血损伤的神经保护作用。但其相关信号转导及调节机制尚需进一步研究,本研究以该通路中重要的细胞内调节因子Smad7为靶点,利用RNA干扰技术抑制Smad7基因表达,检测其对PC12细胞OGD损伤及ActA/Smads通路活化水平的影响,探讨Smad7对ActA/Smads通路的调控机制。

  1材料和方法

  1.1主要材料

  大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞系购自中国医学科学院肿瘤细胞库。兔抗大鼠ActA、Smad7、β-actin抗体购自Santa公司,羊抗兔二抗购自鼎国公司,鼠神经生长因子(NGF)购自Sigma公司,Tr-izol总RNA提取试剂盒购自上海生工公司,Quant-script cDNA合成试剂盒、Real Master Mix(SYBRGreen)试剂盒购自天根公司。Smad7和内参GAP-DH基因引物委托上海生工合成。

  1.2实验方法

  1.2.1 PC12细胞培养及神经元转化含10%马血清及15%胎牛血清的高糖DMEM培养基常规培养PC12细胞,2-3天换液后,当细胞接近80%融合时,胰酶消化传代。细胞贴壁后加入终浓度为50ng/ml的NGF,连续刺激7天以诱导细胞神经元样转化。
  1.2.2氧糖剥夺模型的建立 神经元样PC12细胞经含有10%胎牛血清和1.0mol/L Na2S2O4的无糖DMEM培 养 液 培 养16h,建 立OGD16h组。
  1.2.3大鼠Smad7基因的siRNA合成设计大鼠Smad7基因的siRNA,正义 链5’-aacgaucugcgcucguccggcgudtdt-3’; 反 义 链3’-dtdtuugc-uagacgcgagcaggccgca-5’。SiRNA及阴性对照基因序列委托吉凯生物有限公司合成。
  1.2.4 siRNA转染及分组24孔板内细胞80%融合时行转染,于前一天将培养液更换为不含血清及抗生素的高糖DMEM,分别转染靶向Smad7基因的siRNA,阴性siRNA及对照PBS,建立阳性转染组,阴性转染组及空转染组,转染浓度50nM,24h后行OGD16h。
  1.2.5 Smad7基因mRNA的表达检测收集细胞,Trizol法提取总RNA,逆转录为cDNA。应用ABI7500Fast型实时荧光定量PCR仪对Smad7基因及内参GAPDH mRNA的表达进行检测。引物序 列 如 下:Smad7上 游5'-TCCTGCTGTG-CAAAGTGTTC-3',下 游5'-AGT AAGGAG-GAGGGGGAGAC-3',片 段大小:104bp;GAPDH上游5'-GGT TACCAGGGCTGCCTTCT-3',下游5'-ATGGGTTTCCCGTTGATGAC-3',片 段 大 小:171bp。结果应用Relative Quantification(ddCt)Study软件行相对定量分析。检测实验重复三次。

  1.2.6 MTT细胞存活率检测

  三组细胞以1×104个/孔接种于96孔板,每组10个复孔,各组随机选择5个复孔行OGD16h,每孔加人20μl的MTT(5mg/ml)37℃孵育4h后弃去培养液,加入200μl的二甲基亚砜溶解蓝紫色结晶,充分振荡溶解,应用酶标仪在490nm激发波长测吸光度(A)。OGD16h的A值与OGD0h的A值比较,计算每组细胞存活率。检测实验重复三次。

  1.2.7 Smad7和ActA的蛋白水平检测

  神经元样PC12细胞,经OGD16h处理的阳性及阴性转染组细胞分别消化离心,利用含有1% PMSF的RI-PA裂解提取总蛋白,SDS-PAGE电泳,转膜,封闭,而后分别用兔抗大鼠Smad7(1∶500)和ActA(1∶500)一抗4℃过夜孵育,洗膜,羊抗兔二抗(1∶500)37℃孵育2h,ECL显影压胶片。

  1.3统计学分析

  应用SPSS10.0软件包,计量资料用x珚±s描述,均数间比较采用独立样本t检验,多个均数比较采用单因素方差分析,P<0.05视为有统计学意义。

  2结果

  2.1 Smad7siRNA沉默效果检测

  应用Real Time RT-PCR检测Smad7mRNA的表达变化,阳性转染组Smad7mRNA表达水平(0.32±0.13)较阴性转染组显着下调(0.68±0.14)(见图1)。
  各组Smad7/GAPDH mRNA表达相对定量检测图
  2.2 Smad7及ActA蛋白水平的表达检测

  siRNA转染24h,Smad7及ActA蛋白表达检测显示:OGD16h,siRNA阳性转染组Smad7蛋白表达(0.35±0.08)与阴性组(1.17±0.12)比较,显着下调。OGD后ActA蛋白表达上调,以阳性转染组 为 着 (对 照 组:0.94±0.10,阴 性 转 染 组+OGD16h:1.29±0.13,阳性转染组+OGD16h:2.46±0.16)(见图2)。
  Smad7、ActA蛋白表达检测图
  2.3细胞存活率MTT检测

  OGD16h后MTT细胞存活率检测结果显示:阳性转染组(90.68%±1.31%)与阴性转染组(80.56%±2.13%)及空转染组相比(78.3%±1.72%),存活细胞比例显着升高(见图3)。
  各组细胞存活率检测图
  3讨论

  国内外研究及本课题组的前期工作均证实ActA的抗缺血损伤神经保护作用。目前研究表明,其信号转导机制主要为Smads家族蛋白将胞外信号传递至胞内继而调控核内基因的表达。在该通路信号转导过程中,Smads蛋白作为重要结点,一方面,膜受体激活的Smads2/3和通用Smads(commonmediator Smads,Co-Smads)作为信号转导通路的细胞内传递因子发挥着级联反应功能,另一方面通过抑制性Smads(Smad6/7),抑制该通路的激活 过程。在非神经细胞模型的研究中,Smad7主要通过与抑制性Smads竞争结合TGF-βI型受体以及促进TGF-βI型受体去磷酸化而发挥负性调节作用。但Smad7基因对神经细胞缺血性损伤及其相关的ActA/Smads通路活化的影响目前尚不明确。为此,本研究利用RNA干扰技术,体外设计合成靶向大鼠Smad7基因的siRNA,通过脂质体转染技术,瞬时转染神经元样PC12细胞,继而对Smad7在转录及蛋白水平的表达、细胞对OGD损伤的敏感性及ActA/Smads通路的活化水平进行研究。
  结果发现,PC12细胞经外源性siRNA瞬时转染后,经实时定量PCR及蛋白印记检测均证实细胞内Smad7基因在mRNA及蛋白水平的表达均明显下调,细胞OGD损伤后的存活率升高,与阴性转染组及空转染组相比有显着差异。
  本研究进一步对ActA蛋白的表达情况进行了检测,以明确ActA/Smads通路的活化水平,结果显示OGD损伤刺激激活了调细胞内初级ActA蛋白合成,且此过程受Smad7基因的负向调节。考虑到细胞外ActA是该信号通路的始动因素,目前研究结果提示了ActA/Smads通路活化可能存在着一定程度的环路(反馈)调节,在OGD损伤过程中通过正反馈促进ActA基因表达,维持通路活性,但该机制又受到Smad7基因的负性调控,其途径一方面可能是通过经典机制下调通路活化程度,另一方面可能也与Smad7可以结合核内DNA,干扰可发挥生物 学 功 能 性 的Smads-DNA复合物形成有关。但Smad7对ActA/Smads通路调控的确切机制仍有待于在时间水平上对神经细胞缺血损伤这一动态过程中不同时间位点以及空间水平上在细胞核内的进一步探讨和研究。

  参考文献:
  [1]MassaguéJ,Seoane J,Wotton D.Smad transcription factors[J].Genes Dev,2005,19(23):2783.
  [2]Schubert D,Kimura H,LaCorbiere M,et al.Activin is a nerve cellsurvival molecule[J].Nature,1990,344(6269):868.
  [3]He Jin-Ting,Mang Jing,Mei Chun-Li,et al.NeuroprotectiveEffects of Exogenous Activin A on Oxygen-Glucose Deprivationin PC12Cells[J].Molecules,2011,17(1):315.
  [4]Mukerji SS,Rainey RN,Rhodes JL,et al.Delayed activiA ad-ministration attenuates tissue death after transient focal cerebralischemia and is associated with decreased stress-responsive kinaseactivation[J].J Neurochem,2009,111(5):1138.
  [5]Schmierer B,Hill CS.TGF beta-SMAD signal transduction:mo-lecular specificity and functional flexibility[J].Nat Rev Mol CellBiol,2007,8(12):970.
  [6]Mukerji SS,Katsman EA,Wilber C,et al.Activin is a neuronalsurvival factor that is rapidly increased after transient cerebral is-chemia and hypoxia in mice[J].J Cereb Blood Flow Metab,2007,27(6):1161
  [7]Kato S,Ueda S,Tamaki K,et al.Ctopic expression of Smad7inh-hibit strans-forming growth factor responses in vascular smoothmuscle cells[J].Life Sci,2001,69(22):2641.[8]Ebisawa T,Fukuchi M,Murakami G,et al.Smurf1interacts withtransforming growth factor-beta type I receptor through Smad7and induces receptor degradation[J].J Biol Chem,2001,276:12477.
  [9]Zhang S,Fei T,Zhang L,et al.Smad7antagonizes TGF-βsigna-ling in the nucleus by interfering with functional Smad-DNAcomplex formation[J].MCB,2007,27(12):4488
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